從藍小灰蝶探討，物種生命條碼的差異(Barcoding gap)真的存在嗎?

圖為Agrodiaetus merhaba

圖片引用自: butterflies-moths-turkey.com

文章出處

Martin Wiemers and Konrad Fielder, 2007. Does the DNA barcoding gap exist?- A case study in blue butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae) Frontier in Zoology 4: 8 [pdf]

文章簡介

生命條碼是利用COI的一段序列作為物種快速鑑定的構想，最初是從鳥類以及一部分的節肢動物開始做起，在這兩個類群都顯示出物種間有明顯的基因的歧異度上可以作為鑑識用也就是所謂的生命條碼，後這個構想也幫助隱蔽種(cryptic species)的發現，更有人應用於演化生物學以及系統分類學上，但是有很多的分類學家很不贊同這樣，其中一個原因在於界定物種的生命條碼的差異(Barcoding gap)，可能是人為的因素所造成，起因於物種取樣(不論在種間或種內)不完全所導致。Wiemers & Fielder在2007利用了藍小灰蝶重新檢視生命條碼的差異是否存在。他們所選的Agrodiaetus屬(或亞屬)的藍小灰蝶不同種間有染色體數目上的差異，所以雜交無法受孕(或後代不孕)，也間接提供一個物種鑑定的依據，所以Agrodiaetus屬(或亞屬)的藍小灰蝶，是一個很適合檢測生命條碼的差異是否存在的材料。分析的部分，將基因序列使用K2P model (以便與之前文章比較)所計算出來的遺傳距離(genetic distance)來看種間和種內的差異，或是跑neighbor joing的樹，都無法完全的將種內或種間完全區隔開，換句話說也就是所謂的基因條碼的差異真的只是人為的結果。但是生命條碼對於隱蔽種或新種的發現還是有其重要性在，只是在使用生命條碼時需要更加的嚴謹，除此之外，生命條碼還有一個很基本也很重要的問題要解決，那就是物種的鑑定，Wiemers & Fielder (2007)年文中提到基因庫(Genebank)中幾個物種鑑定錯誤的序列，類似的問題說不定也存在於其他的資料庫中，如果連最基本的問題都沒解決，那生命條碼的可性度就令人質疑了。

毛蟲與蝴蝶並非來自共同祖先, 而是透過基因體的雜交而形成的?

<簡介>

2009年在PNAS上有兩篇文章對於幼蟲是否由有爪動物門（Onychophora；天鵝絨蟲，櫛蠶）經過基因體的雜交演化而來發表了正反兩方的意見。

Williamson反對達爾文認為幼蟲與其成蟲演化自單一祖先的假說，而主張會進行變態的動物之幼蟲基礎形態來自與成體不同的支系；亦即幼蟲的出現是由 成蟲與親緣關係遙遠的動物類群透過有性生殖的結合、發生基因體的雜交轉變而來，然後融合了來自兩個支系的雙重基因體生物，則在時間上依序表現兩組基因體。 起初可能是一個外觀如幼蟲之物種的卵被他種生物的精子授精，然後孵化為幼蟲狀，之後發生變態、再表現另一親代基因體之性狀，形成新的一種生物。此生物接下 來繼續演 化，造成新的動物支系出現。所謂的“Caterpillars”係指具有胸足與腹足之幼蟲形狀的動物，例如鱗翅目、鞘翅目與長翅目的幼蟲。甲蟲、蜂和蠅等 蛆狀的幼蟲由喪失“足”這個特徵的幼蟲演化而來。Williamson認為幼蟲的器官在蛹期被拆解然後重新裝配組合，這種非直接的發育形式（變態）並非僅 是由累積隨機突變、然後受到天擇壓力選汰而產生的結果，而是經由他所提出的基因體雜交理論演化而來。Williamson認為有爪動物門之成員應該是幼蟲 與其蛆狀外觀後裔的演化來源，並提出一個分子生物學的研究計畫，希望基因體學家進行實驗以驗證他的假說。在他的假設中，應該會有2組基因會在具蛆狀幼蟲形 態的所有昆蟲中找到：(i)有爪動物門決定幼蟲狀外觀之蛋白質的編碼序列 與(ii)隨後決定成蟲蛋白質的昆蟲基因。

幾個月後，Harta 與 Grosbergb在PNAS上發表了反駁Williamson的文章，他們認為動物生活史中特殊幼蟲形態的演化與喪失在不同的生活史階段與主要動物類群 之間產生複雜的相似或差異的樣式。其中一個相似的例子就是有爪動物門（Onychophora；天鵝絨蟲，櫛蠶）與某些昆蟲的幼蟲形態。他們認為 Williamson先前在PNAS上發表的看法ー櫛蠶的祖先透過雜交的方式造成昆蟲幼蟲形態的起源，而證據可由現生種櫛蠶、具有以及不具有幼蟲形態的昆 蟲之基因型來比對ー是驚人且無根據的。Williamson已經根據他的假說提出一系列的臆測，並催促基因體學家去測試。因此，他們利用文獻中已有的資料 去證明他的預測是錯誤的，親緣關係遙遠的的動物類群間的雜交無法解釋整體的形態與生活史的演化樣式，且動物的基因與基因體資料提供推翻櫛蠶與特定昆蟲之間 雜交或幼蟲形態轉移的強烈證據。這些證據包括：（1）寄生甲殼類的根頭目藤壺之基因體很小、且不須要從甲殼類身上獲取基因體。（2）完全變態類昆蟲比不具 幼蟲形態的昆蟲所擁有的基因體更小。（3）完全變態類昆蟲的基因比不具幼蟲形態的昆蟲者還要少，且也不須要從櫛蠶身上獲得基因。（4）完全變態類昆蟲並不 具有類似經由雜交而從櫛蠶身上獲得的基因體。（5）有爪動物門的基因體比完全變態類昆蟲還大，且亦並未和昆蟲雜交。

綜合以上兩篇， Williamson提出了神話故事般非常具有創意的假設，也提供了可測試的假說，然後由Harta 與 Grosbergb進行基因體上的比對提出證據反駁，雖然看似正反雙方的意見辯論，但也不能不算是一種科學研究上的合作討論。

文獻來源（1）：DI Williamson. 2009. Caterpillars evolved from onychophorans by hybridogenesis. PNAS.
doi: 10.1073/pnas.0908357106

Abstract
I reject the Darwinian assumption that larvae and their adults evolved from a single common ancestor. Rather I posit that, in animals that metamorphose, the basic types of larvae originated as adults of different lineages, i.e., larvae were transferred when, through hybridization, their genomes were acquired by distantly related animals. “Caterpillars,” the name for eruciforms with thoracic and abdominal legs, are larvae of lepidopterans, hymenopterans, and mecopterans (scorpionflies). Grubs and maggots, including the larvae of beetles, bees, and flies, evolved from caterpillars by loss of legs. Caterpillar larval organs are dismantled and reconstructed in the pupal phase. Such indirect developmental patterns (metamorphoses) did not originate solely by accumulation of random mutations followed by natural selection; rather they are fully consistent with my concept of evolution by hybridogenesis. Members of the phylum Onychophora (velvet worms) are proposed as the evolutionary source of caterpillars and their grub or maggot descendants. I present a molecular biological research proposal to test my thesis. By my hypothesis 2 recognizable sets of genes are detectable in the genomes of all insects with caterpillar grub- or maggot-like larvae: (i) onychophoran genes that code for proteins determining larval morphology/physiology and (ii) sequentially expressed insect genes that code for adult proteins. The genomes of insects and other animals that, by contrast, entirely lack larvae comprise recognizable sets of genes from single animal common ancestors.

文獻來源（2）：MW Hart and RK Grosberg. 2009. Caterpillars did not evolve from onychophorans by hybridogenesis. PNAS.
doi: 10.1073/pnas.0910229106

Abstract
The evolution and loss of distinctive larval forms in animal life cycles have produced complex patterns of similarity and difference among life-history stages and major animal lineages. One example of this similarity is the morphological forms of Onychophora (velvet worms) and the caterpillar-like larvae of some insects. Williamson [(2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:15786–15790] has made the astonishing and unfounded claim that the ancestors of the velvet worms directly gave rise to insect caterpillars via hybridization and that evidence of this ancient “larval transfer” could be found in comparisons among the genomes of extantextant onychophorans, insects with larvae, and insects without larvae. Williamson has made a series of predictions arising from his hypothesis and urged genomicists to test them. Here, we use data already in the literature to show these predictions to be false. Hybridogenesis between distantly related animals does not explain patterns of morphological and life-history evolution in general, and the genes and genomes of animals provide strong evidence against hybridization or larval transfer between a velvet worm and an insect in particular.

寄主植物親緣關係與生長形式對廣食性的黃鉤蛺蝶有基因表現上的影響

文獻來源：HM Heidel-Fischer, D Freitak, N Janz, L Söderlind, H Vogel, S Nylin. 2009. Phylogenetic relatedness and host plant growth form influence gene expression of the polyphagous comma butterfly (Polygonia c-album). BMC Genomics 10:506. doi:10.1186/1471-2164-10-506

關於限制植食性昆蟲食性範圍的機制目前尚未研究透徹，但是針對影響他們的機制與選汰力量之研究能使人們更了解較大尺度的生態交互作用。目前已知植物的化學防禦物質可影響植食性昆蟲的食性範圍，而植物的化學防禦物質則受植物親緣關係之影響、植物的生長形式亦會影響植物的防禦策略（首先是由Feeny, P.在1976年所提出的"plant apparency"假說）。在本研究中，作者希望藉由檢測取食三種不同寄主植物的幼蟲之基因表現，以分析出黃鉤蛺蝶(Polygonia c-album)能取食多樣化的植物之分子層次基礎，此三種植物為近緣關係(Urtica dioica and Ulmus glabra- 皆為蕁麻目)或有相同生長形式 (Salix caprea and Ulmus glabra -皆為樹木)。
作者在取食不同植物後的黃鉤蛺蝶身上總計找到120個具有差異表現的基因，其中55個位於中腸、65個位於幼蟲身體的其他部位。27個選取的測試基因中有14個 (10 in 中腸 and 4 in 身體其他部位)的表現樣式可以以獨立方法進行確認。對幼蟲中腸基因表現進行配對的相似性比較顯示，無論是在近緣的植物或具有相同生長形式的植物之間，均具有較高的相似性。相反地，幼蟲身體其他部位的基因與植物的類別間則無相對應的樣式。然而在取食不同寄主植物的幼蟲中腸中並未找到不同的解毒酵素以進行不同的調節。作者的研究資料顯示基因表現對取食不同寄主植物的反應是很複雜的，雖然每種植物需要幼蟲獨特的基因調節，但是寄主植物間親緣關係與寄主植物生長形式看來亦能影響廣食性的黃鉤蛺蝶之基因表現，此與蝶類寄主植物利用的親緣關係研究結果一致。

Background
The mechanisms that shape the host plant range of herbivorous insect are to date not well understood but knowledge of these mechanisms and the selective forces that influence them can expand our understanding of the larger ecological interaction. Nevertheless, it is well established that chemical defenses of plants influence the host range of herbivorous insects. While host plant chemistry is influenced by phylogeny, also the growth forms of plants appear to influence the plant defense strategies as first postulated by Feeny (the "plant apparency" hypothesis). In the present study we aim to investigate the molecular basis of the diverse host plant range of the comma butterfly (Polygonia c-album) by testing differential gene expression in the caterpillars on three host plants that are either closely related or share the same growth form.
Results
In total 120 genes were identified to be differentially expressed in P. c-album after feeding on different host plants, 55 of them in the midgut and 65 in the restbody of the caterpillars. Expression patterns could be confirmed with an independent method for 14 of 27 tested genes. Pairwise similarities in upregulation in the midgut of the caterpillars were higher between plants that shared either growth form or were phylogenetically related. No known detoxifying enzymes were found to be differently regulated in the midgut after feeding on different host plants.
Conclusion
Our data suggest a complex picture of gene expression in response to host plant feeding. While each plant requires a unique gene regulation in the caterpillar, both phylogenetic relatedness and host plant growth form appear to influence the expression profile of the polyphagous comma butterfly, in agreement with phylogenetic studies of host plant utilization in butterflies.

粒線體與微衛星體DNA標記顯示具高入侵性的七葉樹潛蛾起源自巴爾幹半島

圖片來源：dendro.mojzisek.cz

Mitochondrial and microsatellite DNA markers reveal a Balkan origin for the highly invasive horse-chestnut leaf miner Cameraria ohridella (Lepidoptera,Gracillariidae)

文獻來源: Valade R, Kenis M, Hernandez-Lopez A, Augustin S, Mari Mena N, Magnoux E, Rougerie R, Lakatos F, Roques A, Lopez-Vaamonde C. 2009. Mitochondrial and microsatellite DNA markers reveal a Balkan origin for the highly invasive horse-chestnut leaf miner Cameraria ohridella (Lepidoptera, Gracillariidae). Molecular Ecology 18(16): 3458 - 3470. [Abstract]

生物入侵通常始於少量的創始者個體。創始者很可能只表現出來源族群一小部分的遺傳多樣性。本研究以遺傳方式追蹤七葉樹潛蛾（Cameraria ohridella，一種起源地未明的入侵性小鱗翅目昆蟲）的地理起源。自從25年前在馬其頓的發現後，這種昆蟲經歷了爆炸性的向西擴張，日益拓殖到整個中歐與西歐。作者使用COI序列（DNA條碼片段）與一組六個多型性的微衛星體去評估七葉樹潛蛾族群的遺傳變異，並測試七葉樹潛蛾起源自南巴爾幹半島（阿爾巴尼亞、馬其頓和希臘）的假說。來自88的地點共486個樣本的mtDNA讓我們鑑定出了25個地理結構上的單體型。此外，來自歐洲與南巴爾幹半島的 16個族群、共480個個體在基因上被找出6個多型性的微衛星體基因座。單體型具有高多樣性而核甘酸多樣性測量值低、包括顯著負相關的 Tajima’s D指數，表示七葉樹潛蛾在擴散橫越歐洲時曾經歷快速的族群擴張。粒線體與微衛星體DNA均顯示來自歐洲人為棲地（如公園、花園中的植樹或道路兩邊的空地）的七葉樹潛蛾與來自南巴爾幹半島自然棲地的樣本相較，有遺傳多樣性減低的現象。作者根據以上發現推測，歐洲的七葉樹潛蛾族群的確源自於南巴爾幹半島。

Abstract
Biological invasions usually start with a small number of founder individuals. These founders are likely to represent a small fraction of the total genetic diversity found in the source population. Our study to trace genetically the geographical origin of the horse-chestnut leafminer, Cameraria ohridella, an invasive microlepidopteran whose area of origin is still unkown. Since its discovery in Macedonia 25 years ago, this insect has experienced an explosive westward range expansion, progressively colonizing all of Central and Western Europe. We used cytochrome oxidase I sequences (DNA barcode fragment) and a set of six polymorphic microsatellites to assess the genetic variability of C. ohridella populations, and to test the hypothesis that C. ohridella derives from the southern Balkans (Albania, Macedonia and Greece). Analysis of mtDNA of 486 individuals from 88 localities allowed us to identify 25 geographically structured haplotypes. In addition, 480 individuals from 16 populations from Europe and the sout ern Balkans were genotyped for 6 polymorphic microsatellite loci. High haplotype diversity and low measures of nucleotide diversities a significantly negative Tajima’s D indicate that C. ohridella has experienced rapid population expansion during its dispersal across Europe. Both mtDNA and microsatellites show a reduction in genetic diversity of C. ohridella populations sampled from artificial habitats (e.g. planted trees in public parks, gardens, along roads in urban or sub-urban areas) across Europe compared with C. ohridella sampled in natural stands of horse-chestnuts in the southern Balkans. These findings suggest that European populations of C. ohridella may indeed derive from the southern Balkans.

Keywords: Aesculus hippocastanum, Balkans, Cameraria ohridella, genetic bottleneck, invasion, phylogeography

Received 11 September 2008; revision received 26 May 2009; accepted 30 May 2009

蝴蝶翅膀特徵的環境壓力與數量遺傳變異

Environmental stress and quantitative genetic variation in butterfly wing characteristics

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Evol Ecol (2009) 23:473–485 DOI 10.1007/s10682-008-9246-4

W. Talloen AE S. Van Dongen AE H. Van Dyck AE L. Lens

蝴蝶翅膀特徵廣泛地被用作模式系統使用在發育、數量遺傳與表型可塑性的研究上。然而，雖然在演化上有關聯，選汰壓力對遺傳變異本身表現的影響確很少被研究。在這篇文章中，作者探討斑點木蝶（Pararge aegeria）翅紋特徵的遺傳變異如何隨著寄主植物的乾燥程度梯度而變化。測量部位包括前翅區域、基部與末端的黑化程度以及五個黃色斑紋的區域。作者發現表現在黑化的程度的遺傳變異隨著乾燥壓力的提升而增加，且類似地(雖不顯著)，與前翅尺寸相關。結果顯示，狹義“遺傳力(heritability)“的上限、與翅的大小和黑化程度的加成性遺傳變異，都隨著乾燥壓力而上升。不同黃色斑點的樣式則關聯較低，推測存有遺傳變異與環境壓力之間的特徵專一性。

Abstract
Butterfly wing characteristics are extensively used as model system in studies of development, quantitative genetics and phenotypic plasticity. In spite of its evolutionary relevance, however, the effect of stress on the expression of genetic variation itself has only rarely been studied. In this paper, we explore genetic variation of wing characteristics of the Speckled wood Pararge aegeria along a host plant drought stress gradient. Forewing area, basal and distal degree of melanization and the area of five yellow wing spots were measured. We found an increase in (additive) genetic variation in degree of melanization at
higher drought stress, and a similar, yet non-significant, relationship for forewing size. As a result, both the upper limits of the narrow-sense heritability and the coefficient of additive genetic variation of wing size and melanization increased with drought stress. Patterns for the different yellow wing spots were less consistent, suggesting trait-specificity in the relationships between genetic variation and environmental stress.

受保護之西班牙水青蛾的十個多型性微衛星體基因座之特性

photo by:TPittaway

Characterization of ten polymorphic microsatellite markers for the protected Spanish moon moth Graellsia isabelae (Lepidoptera: Saturniidae)

M. Vila, N. Mari Mena, S-H. Yen & C. Lopez-Vaamonde (2009)
Conservation Genetics. DOI 10.1007/s10592-009-9905-1

本研究發展出十個西班牙月蛾的多型性微衛星體基因座。作者對來自一個西班牙族群(Els-Ports-de-Beseit, Catalonia)的20個個體、39個來自法國山區的個體和6個來自西班牙其他地點的個體進行多型性的評估。整體而言，基因座上的對偶基因數量範圍為 5-24個。 Els-Ports-de-Beseit族群每個基因座上的平均對偶基因數量是 9.80 (SD = 4.32)，異型合子比例為 0.71 (SD = 0.226)，異型合子比例的期望值是0.788 (SD = 0.146)。Catalonia族群的基因型頻率符合哈溫平衡，且沒有觀察到連鎖不平衡的證據。由這組標誌所得之多基因座基因型將可應用在判斷此高度保育蛾種的遺傳岐異度與族群間的分化。有一些基因座在兩種近緣種上被找到且具有多型性: 在Actias neidhoeferi (姬長尾水青蛾)上有兩個基因座，A. luna則有三個。

Abstract Ten polymorphic microsatellite loci were developed for Graellsia isabelae. Polymorphism was assessed for 20 individuals from a Spanish population (Els-Ports-de-Beseit, Catalonia) and 39 more individuals from bone population in the French Alps and six other Spanish localities. Overall, the number of alleles per locus ranged from 5 to 24. Els-Ports-de-Beseit showed an average number of alleles per locus of 9.80 (SD = 4.32), observed heterozygosity was 0.71 (SD = 0.226), and expected heterozygosity was 0.788 (SD = 0.146). Genotypic frequencies conformed to Hardy–Weinberg equilibrium at the Catalonian population, and no evidence for linkage disequilibrium was observed. Multilocus genotypes resulting from this set of markers will be useful to determine genetic diversity and differentiation within and among populations of this highly protected moth. Several loci amplified and resulted polymorphic in two related species: two loci in Actias neidhoeferi, and three loci in A. luna.

Graellsia isabelae 研究群: Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) - Centre d'Orléans 網站

夏季型與遷徙型帝王蝶的行為與分子上差異之解釋

Monarch butterflies. (Credit: iStockphoto/Paul Tessier)

Defining behavioral and molecular differences between summer and migratory monarch butterflies

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Haisun Zhu , Robert J Gegear , Amy Casselman , Sriramana Kanginakudru and Steven M Reppert

BMC Biology 2009, 7:14

東部的北美帝王蝶在秋季會進行相當長距離的遷徙。與春夏季蝴蝶比較，秋季的遷徙者的青春激素是有缺陷的，因而導致生殖停滯與延長壽命的現象。遷徙者也使用時間補償式的太陽羅盤幫助他們導航前往墨西哥的（西）南方向。此領域的中心議題是定義出青春激素的地位與飛行導向之間的關係、夏季帝王蝶和秋季遷徙者之間的關鍵特徵，以及與行為狀態相關的分子。

在此研究中，作者發現對秋季遷徙者增加青春激素活性會促進如夏季一般的生殖發育，但是不會改變方向性的飛行行為或時間補償的導航。 相反的，有生殖能力的夏季個體皆無法表現出方向性飛行或是導航的行為。作者使用9417 unique cDNA進行微陣列資料分析以定義與行為狀態相關的分子，基因表現數據顯示有一系列40個基因在腦中對個體遷徙的導航飛行行為有不同的表現、且與青春激素的活性無關，從而在分子層次上區分秋季與夏季的個體。這些具差異調節的複雜基因包括時鐘基因vrille和酪胺酸β水解脢。此外這些基因中有37.5%是尚未被註解的，作者鑑定了腦中的23個與青春激素有關、可區別帝王蝶是否具生殖能力的基因；也發現涉及長壽、脂肪酸代謝與免疫力的基因在無生殖能力的遷徙者（青春激素有缺陷）中有被促進的現象。

本研究成果連結了遷徙者和夏季蝴蝶之行為與腦中基因表現數據，且顯示出基因功能的季節性改變有助於定義遷徙狀態。

尾突也可抽DNA- 保育類蛾種的非致死取樣方法之效果

photo by: José Miguel Nieto Ojeda

Effect of non-lethal sampling on life-history traits of the protected moth Graellsia isabelae (Lepidoptera: Saturniidae)
Ecological Entomology (Accepted 4 December 2008, 將於2009近期出刊,尚未上線)

M . Vila ¹, M . A . Auger-Rozenberg² , F. Goussard ²and C . Lopez-Vaamonde^2
1 Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Sciences, University of A Coruna, A Coruna, Spain and ² INRA, UR 633 Zoologie Forestière, Orléans, France

在昆蟲方面使用非致死的取樣方法通常是由一隻腳或翅膀的一部分中萃取DNA，雖然比殺死動物以取得樣本更好，但關於缺少一隻腳或一部分翅膀對昆蟲個體的生存或繁衍有何影響並不清楚。Graellsia isabelae是一種受到生境指令與伯恩公約保護的歐洲蛾類，在保育遺傳學上的取樣必須採用非致死方式，作者的研究目標是(1)量化從腳和後翅尾突取得DNA樣本對於雌雄成蟲的生存和繁殖的影響，以及(2)評估由這些組織中萃取DNA的量與品質。結果顯示後翅尾突和中足都是品質良好的核DNA與粒線體DNA來源，且取自大於130mm²的後翅尾突的DNA濃度顯著高於來自大約半截中足的DNA濃度。對成蟲進行捉放法的結果顯示無論是後翅尾突或是中足被取樣，對於雄性的存活率或交配總次數都沒有顯著的減少；然而雖然少了中足對於母蛾的生存沒有顯著影響，卻對其能否成功交配有負面的影響。修剪雄蛾後翅對G. isabelae而言似乎是最好的非致死取樣方式，既快速又與自然造成的翅膀損傷類似，對其生存或交配行為沒有顯著影響。

Abstract
1. Non-lethal genetic surveys in insects usually extract DNA from a leg or a piece of wing. Although preferable to lethal sampling, little is known about the effect of leg/wing non-lethal sampling on fitness-related traits. 2. Graellsia isabelae (Graells, 1849) is a European moth protected by the Habitats Directive and the Bern Convention. Conservation genetics surveys on this species should therefore use non-lethal sampling. 3. The present study aimed to (1) quantify the effects of both leg and hind-wing tail sampling on survivorship and reproductive behaviour of adult males and females, and (2) assess the quality and quantity of DNA obtained from those tissues. 4. Both hind-wing tails and mid-legs proved to be good sources of high quality nuclear and mitochondrial DNA. DNA concentration was significantly higher when extracted from a large (130 mm 2 ) piece of the hind-wing tails than from about half of the mid-leg. Using mark – release – recapture experiments with adults, it was found that neither midleg nor hind-wing tail sampling significantly reduced male survivorship or total number of matings. However, although mid-leg sampling did not significantly affect female survivorship, it had a negative effect on female mating success. 5. Wing-tail clipping on males appeared to be the best non-lethal sampling procedure for G. isabelae . It is a fast procedure, similar to natural wing impairment, and did not significantly affect survival or mating behaviour.

翅、角與眼紋：複雜的特徵如何演化出來?

Wings, Horns, and Butterfly Eyespots: How Do Complex Traits Evolve?

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Antónia Monteiro and Ondrej Podlaha (2009) PLoS Biol 7(2): e1000037

在演化的過程中，生物發展出各式各樣複雜的特徵以提升其生存或生殖機會，諸如昆蟲的翅膀可增進擴散能力、甲蟲碩大的角幫助求偶、蝶與蛾的眼斑用以嚇退天敵，但究竟這些複雜的特徵從何而來，仍是個未解之謎。近四十年來的研究發現，新的特徵是由舊的基因以新的連結方式所產生，但是細節仍然未知，究竟是舊的基因同時產生全新的連結方式？還是一串串原已連結好的基因再被選入發育為新特徵的過程中？

目前，關於取得適應或是新的形態特徵的了解大多來自於單一基因的研究。
一部分著重於酵素編碼位置的突變對於形態所造成的影響，另一方面剖析引起現存特徵改變或消失在遺傳或發育上有何變化。但鮮少有研究直接處理新的複雜特徵在遺傳或發育上的起源。

有功能的新的複雜網絡如何產生？
複雜的特徵需要許多轉錄因子與訊號傳遞路徑的協調去引導它的發育，建立一個全新的發育途徑涉及逐一連結許多基因、需要每一個突變從漂變成為穩定、或者確認在中間過程的每一步有某些選汰優勢。雖然這樣冗長的過程並非完全沒有可能，它也可採取較少步驟的方式- 將已存在的基因網路重新共同選擇(Gene network co-option)，在接著作些微的修飾使其角色最符合新的發育特徵。
Gene network co-option幾乎是個新概念，常被用來解釋為何同一組基因會表現在兩個不同的發育脈絡上，例如Distal-less (Dll)基因表現在甲蟲成蟲的角的末梢、也表現在蝴蝶眼紋的中央，其下游基因spalt也同時表現在觸角和眼紋上。但是新網絡連結的觀念仍然只是個可能的假說，尚未發展出進一步測試去分辨兩者的機制，因為兩個非此即彼的機制非常難以覺察。兩個不同源的特徵共用相似的基因、並具有相似的時間上表現樣式，有兩種可能的解釋： (1)同一個基因網絡被增選(co-option)以產生兩個非同源特徵；(2)這些發育脈絡使用相同的基因建立相似卻互相獨立的基因網絡。

如何應付這個問題？
作者提出一個經驗上的測試將基因網絡增選(co-option)從全新的網絡演化中區辨出來，假設這些不同的演化模式在該網絡的基因上產生不同數量的調控單元(cis-regulatory elements, CREs)，CREs與基因在發育網絡上的連結可以提供演化歷史的資訊。當co-option產生時，與上游調控基因相連的CREs應該會繼續在多個發育脈絡中具有功能，這挑戰了最初的發育遺傳學上所暗示的假設-一個CRE驅動一個特定樣式的基因表現且造成一個特定的發育脈絡。

如何找出基因網絡的co-option？
對於新的特徵在基因網絡層面上是如何重新”接線”的，作者提出兩種不同的方案：(1)透過上游基因X的CRE之演化作co-option，則其下游Y和Z基因的CREs應可表現在兩個不同的發育脈絡上(如下圖B).；(2)Y和Z基因專屬且複雜的CREs需為每一個發育脈絡各自演化，並整合來自上游的調節因子以表現在正確的組織或器官上(如下圖C)，新增的CREs必須來自新的演化而非具有多效性功能。 哪些資料支持CREs可作用在多個發育脈絡上？
作者舉出一些實例如下圖，這些資料推測一個網絡的co-option是由於上游調節因子的調度，再號召內部網絡中的基因形成新的發育脈絡，形成多功能(且具多效性表現的)CREs。

哪些資料支持新連結網絡演化的存在？
為了將兩個相似的基因網絡認定為非同源(nonhomologous)，在以作者提出的骨架檢驗其基因網絡連結細節之前，重要的是先確認它們的相似是來自於直向同源(orthologous) 而不是旁系同源(paralogous)、且基因之間相同功能適當連結連結。以眼睛的發育網絡舉例，其某些組成的基因不符合上列原則，可能是這些基因在不同的支系以全新的方式連結。比較昆蟲與脊椎動物的眼睛發育網絡，即便其中某些基因是相似的，但是某些基因並非orthologous而是paralogous copies，且兩者功能上的關係是不同的。此例比較不同生物間的基因網絡而非同一個個體之內，但核心問題是一樣的：這兩種不同的眼睛發育網絡是否來自於同一個祖先？
由於這些旁系同源基因(sine oculis in Drosophila, and Six3 and Optx2 in Xenopus)早在昆蟲與脊椎動物分化之前即已存在，假設它們在各自的支系中發展出眼睛發育網絡，或假設這兩份copies如副本般保存、且長期冗贅地表現眼睛基因直到在各自的支系中被壓制，前者會比後者更儉約。

多效性CREs有何演化上的暗示？
生物學家對於何種基因改變對於適應性演化變異最有影響存有爭議，主要被認為會發生改變的兩個位置為調節DNA與蛋白質編碼DNA，爭議的中心為那個位置遭受最少量的多效性(pleiotropy)。支持non-coding DNA region的人認為模組化的CREs允許基因發展出新的功能且不至於减損就有的功能，因為不需要發生蛋白質序列上的改變。但是現有的證據顯示，蛋白質(包括Hox proteins)本身高度地模組化，亦即蛋白質的不同部位可與不同的co-factors結合，而蛋白質的修改也許會影響其中一種功能、但並非同時影響所有功能。作者認為討論蛋白質或調節序列何者對適應性演化有較大的作用，或許太過簡化甚至可能誤導，這兩者都可以模組化且具多效性，故討論應該轉而著重於是否模組化的網絡在發育系統中是常見的、網絡的大小、基因網絡的co-option在建構基因的調解區域時扮演何種角色。另一個重點是，CREs包含了許多型的轉錄因子結合區域，可調節位在同一個空間區域中基因或對同一個環境刺激作出反應。

關於解答
對於完全了解新特徵如何演化出來仍有待努力，作者在本文提出一個試驗性的骨架供測試新的特徵是否由已經存在的基因網絡中演化而來。為解答此問題，必須持續探索還有哪些基因在不同的特徵上有作用、以鑑定出那些作用類似整合或脈絡不敏感的基因網絡，這些基因的CREs應該在橫跨不同發育脈絡的多個表現區域上進行測試。如果同一個CRE驅使基因表現在不同的結構上，網絡重新增補便是最可能的機制；假如並非如此，則此網絡連結可能是全新打造的了。

相關背景知識參考
新世紀生命科學課程改進計畫 發育生物學 第十五章