文獻來源：AK Hundoerfer, IJ Kitching. 2010. A Method for Improving DNA Yield from Century-plus Old Specimens of Large Lepidoptera while Minimizing Damage to External and Internal Abdominal Characters. Arthopod Systematics & Phylogeny 68(1): 151-155.Abstract
The external and internal genitalia of Lepidoptera have long provided a wealth of taxonomic and phylogenetic characters. However, traditional genitalia preparation techniques destroy both DNA, which is increasingly being used in Lepidoptera phylogenetics and species discrimination, and the scale pattern of the abdomen. In this paper, we describe a procedure for extracting both DNA for sequence analysis and genitalia from large Lepidoptera while retaining the surface scaling of the abdomen and, by permitting reattachment of the empty but still scaled abdomen, the general appearance of the specimens. Specimens both before and after the procedure has been undertaken are illustrated.
簡介
一. 介紹
鱗翅目的成蟲腹部生殖器結構在鑑定、分類特徵以及親緣關係重建上一直被認為具有豐富的資訊。解剖並檢視此形態結構的前置方法，大多以KOH水溶液來進行軟化、去除雜質、鱗片與毛等" 清潔(cleaning)"步驟，然而此程序無法將肌肉與其他內部結構保留，更遑論DNA資訊的保存。過去研究者若想取得老鱗翅目標本(通常指保存約 50~100年的針插乾燥標本)的DNA，主要來源是拔取標本的其中一隻足，然而文章作者認為：博物館館藏 經理(curator)並不希望因為量少而甚至無法預期能否成功獲得的DNA片段，去允許研究者破壞其館藏標本的一部份，儘管該部份所造成的標本損壞可能 非常微小，況且實際上從古老標本的一隻足所能獲得DNA量也不多。作者提出：當需要針對具歷史價值的珍貴老標本進行生殖器資訊分析時，可以透過改變操作流 程ー即在直接使用會破壞DNA的KOH溶液作為軟化劑之前，加入可保存DNA的步驟ー以使標本在最少量破壞 下獲得最多的形態與分子資訊。類似的概念與方法已在Knölke et al. (2005)提出，該文章選用的材料為較小型的鱗翅目，由於目前並不認為小型鱗翅目的腹部特徵能提供親緣關 係重建之資訊，故過程中會將腹部鱗片去除，而本次介紹的文章則針對體型較大的鱗翅目天蛾科類群Hyles屬來測試此方法的可行性，以及說明操作流程當中保 留腹部鱗片特徵之方法。
二. 方法
1. 由於任何解剖與移除標本的結構皆會使標本失去部份的形態資訊，故在事前必須以高解析度影像做標本處理前的紀錄。
2. 解剖工具如鑷子或夾子等可能帶有其他DNA殘餘物者，以浸泡在96% denatured ethanol中並置以火烤一小段時間處理，再用DNA-free的工具由標本取下主要含生殖器結構的腹部節段。
3. 將單一腹部樣本放於合適大小的管中並加入足夠的diluted lysis buffer水溶液，浸置於攝氏55度環境，視取得之腹部大小狀態評估時間長短。
4. 當腹部內部組織軟化時，以pipette將過量的 diluted lysis buffer取出，並可將腹部一側剪開，使後續的蛋白質水解溶能夠更有效率的作用，若需要保留鱗片資訊則應避免解剖過程中任何的晃動。
5. 將腹部由buffer取出，在顯微鏡下操作將軟化組織取出再度置於蛋白質水解溶液中，並減少生殖器結構的破壞。後續將軟化組織放入DNA-free管中並 儲存於攝氏-20～-80度狀態中，供未來DNA分析用。
6. 將生殖器由腹部取下以KOH溶液溶解其他非骨化區殘質，後續步驟以如同過去的生殖器解剖流程處理此結構。
7. 剩餘的腹部骨化區與附著未脫落的鱗片依序以水、70%酒精洗淨後風乾，情況許可下將此結構以水性昆蟲膠黏回標本原位。
8. 使用抽取古老DNA (acient DNA, aDNA)的kit進行DNA萃取、以小而重疊的引子設計片段來增幅目標基因，後續再以軟體編輯整段目標基因的片段以及重建其親緣關係。
三. 結果
文章作者選用四隻標本年齡在45~103年的天蛾科Hyles屬標本進行測試，將所選取粒線體的三個基因 (COI, COII, tRNA-leu)分成13個長度約110–280 bp的片段進行定序，成功率在81~88%(最古老的103年標本達84%)。相較於過去以古標本足部來抽取DNA的方法，新方法可獲得更大的DNA量。 而新方法使取用腹部與生殖器進行形態分析的事件透過步驟的改變獲得了DNA抽取的加值與標本破壞的可能性降低。然而整個流程也有一些小缺點：(1) 比傳統上以KOH溶液溶解非骨化組織、並直接取得乾淨的生殖器結構資訊來得費時(傳統上只需數小時至一天，新方法至少需兩天半) 以及(2)需要準備更多的設備，例如DNA-free的解剖器具與瓶管容器。 此外，新方法亦可使用於年輕標本，只要選擇適當的kit即可操作。
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