以分子證據重建擬捲葉蛾科(Choreutidae)之親緣關係

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[文獻來源][原文網址] Rota J. (2011). Data partioning in Bayesian analysis: molecular phylogenetics of metalmark moths (Lepidoptera: Choreutidae). Systematic Entomology, 36: 317-329.

[文章簡介] 本篇文章利用COI、Ef1a與wingless等分子片段重建擬捲葉蛾科的高階親緣關係，內群取樣包含在擬捲葉蛾科中的三個亞科（擬捲葉蛾亞科(Choretinae)、舞蛾亞科(Brenthiinae)、密勒蛾亞科(Millieriinae)），共取樣21個屬中的13個屬。作者利用貝氏分析法與資料區分(data-partitioning)策略；資料共區分為每個分子片段矩陣、核基因片段矩陣與全基因片段矩陣，利用資料區分分析後發現對於結果有明顯的影響，根據資料區分的形式，樹的支持度會有所差異。在資料分析方面，本文章也測試了Bayesian star tree paradox（註），結果發現在Hemerophila hourruinialis, H. diva與H. felis的支系上，其支持度會被假性提高，而其他高支持度的支系並沒有發現這樣的現象。親緣關係的結果支持密勒蛾亞科與捲葉蛾科應為複系群，舞蛾亞科與擬捲葉蛾亞科強烈被支持為姊妹群。除了Hemerophila屬外，其他屬的單系性也被支持。根據其結果，本篇作者建議應將密勒蛾亞科從擬捲葉蛾科中移出，並從亞科級提升為科級，但其在雙孔群中的地位仍不清楚。

註：Bayesian star tree paradox為一種貝氏分析法重建親緣關係時的矛盾，最基礎的理論為若一個已置根有三個分類群的三叉樹，若要產生二叉樹時，則每個二叉樹所產生的機率皆不滿1/3，這個現象在大型矩陣中可能影響事後機率(posterior probability)的估算。

結合不同取樣方法以研究幼蟲組成之可行性- 以安地斯山脈森林區的灌木叢為例

文獻來源：F Bodner, S Mahal, M Reuter and Fiedler. 2010. Feasibility of a combined sampling approach for studying caterpillar assemblages – a case study from shrubs in the Andean montane forest zone. The Journal of Research on the Lepidoptera 43: 27-35.

摘要
作者分析結合不同取樣方法: 目視搜尋法(visual search)與枝條敲擊法(branch-beating)以評估熱帶地區幼蟲的群聚組成。研究在厄瓜多的山區進行，選取胡椒屬(Piper)的兩種植物作為目標植物。作者在四個以標準化採樣流程進行的實驗過程中共取樣了160株灌木，然後每一株灌木被進行徹底的逐葉檢視搜索至完全地去除葉片為止，以求能100%地搜尋到該植物上的每一隻幼蟲。作者將資料針對完整度、分類上的誤差、日照長度造成之影響、灌木結構複雜度與研究人員的研究經驗進行分析。依標準化採樣流程進行的實驗可採得一株灌木上50.6%~71.6%的幼蟲。取樣流程中分類上的誤差很小，但是可能是由於其簡單和可預測的特性，故很容易說明。本研究中並未發現任何日照長度造成的顯著影響。灌木大小與結構複雜度對取樣結果造成的影響很大，原因是在本研究中，植株小而結構簡單的灌木能幾乎被取樣的很徹底，然而植株大而結構複雜的灌木則大多無法完全徹底的取樣。在逐片葉片的窮盡搜尋方法中，研究經驗的豐富程度對取樣效率和樣本物種組成並未有顯著的影響；然而，在比較搜尋到的幼蟲體型方面，缺乏野外研究經驗的人員則顯然會完全忽略掉最小型的幼蟲。
作者的結論是：此標準化的結合不同取樣方法的流程對研究幼蟲群聚組成之研究相當適合。

如何從大型鱗翅目的百年標本獲得DNA資訊並減低標本破壞的程度

文獻來源：AK Hundoerfer, IJ Kitching. 2010. A Method for Improving DNA Yield from Century-plus Old Specimens of Large Lepidoptera while Minimizing Damage to External and Internal Abdominal Characters. Arthopod Systematics & Phylogeny 68(1): 151-155.

Abstract
The external and internal genitalia of Lepidoptera have long provided a wealth of taxonomic and phylogenetic characters. However, traditional genitalia preparation techniques destroy both DNA, which is increasingly being used in Lepidoptera phylogenetics and species discrimination, and the scale pattern of the abdomen. In this paper, we describe a procedure for extracting both DNA for sequence analysis and genitalia from large Lepidoptera while retaining the surface scaling of the abdomen and, by permitting reattachment of the empty but still scaled abdomen, the general appearance of the specimens. Specimens both before and after the procedure has been undertaken are illustrated.

簡介
一. 介紹
鱗翅目的成蟲腹部生殖器結構在鑑定、分類特徵以及親緣關係重建上一直被認為具有豐富的資訊。解剖並檢視此形態結構的前置方法，大多以KOH水溶液來進行軟化、去除雜質、鱗片與毛等" 清潔(cleaning)"步驟，然而此程序無法將肌肉與其他內部結構保留，更遑論DNA資訊的保存。過去研究者若想取得老鱗翅目標本(通常指保存約 50~100年的針插乾燥標本)的DNA，主要來源是拔取標本的其中一隻足，然而文章作者認為：博物館館藏 經理(curator)並不希望因為量少而甚至無法預期能否成功獲得的DNA片段，去允許研究者破壞其館藏標本的一部份，儘管該部份所造成的標本損壞可能 非常微小，況且實際上從古老標本的一隻足所能獲得DNA量也不多。作者提出：當需要針對具歷史價值的珍貴老標本進行生殖器資訊分析時，可以透過改變操作流 程ー即在直接使用會破壞DNA的KOH溶液作為軟化劑之前，加入可保存DNA的步驟ー以使標本在最少量破壞 下獲得最多的形態與分子資訊。類似的概念與方法已在Knölke et al. (2005)提出，該文章選用的材料為較小型的鱗翅目，由於目前並不認為小型鱗翅目的腹部特徵能提供親緣關 係重建之資訊，故過程中會將腹部鱗片去除，而本次介紹的文章則針對體型較大的鱗翅目天蛾科類群Hyles屬來測試此方法的可行性，以及說明操作流程當中保 留腹部鱗片特徵之方法。

二. 方法
1. 由於任何解剖與移除標本的結構皆會使標本失去部份的形態資訊，故在事前必須以高解析度影像做標本處理前的紀錄。
2. 解剖工具如鑷子或夾子等可能帶有其他DNA殘餘物者，以浸泡在96% denatured ethanol中並置以火烤一小段時間處理，再用DNA-free的工具由標本取下主要含生殖器結構的腹部節段。
3. 將單一腹部樣本放於合適大小的管中並加入足夠的diluted lysis buffer水溶液，浸置於攝氏55度環境，視取得之腹部大小狀態評估時間長短。
4. 當腹部內部組織軟化時，以pipette將過量的 diluted lysis buffer取出，並可將腹部一側剪開，使後續的蛋白質水解溶能夠更有效率的作用，若需要保留鱗片資訊則應避免解剖過程中任何的晃動。
5. 將腹部由buffer取出，在顯微鏡下操作將軟化組織取出再度置於蛋白質水解溶液中，並減少生殖器結構的破壞。後續將軟化組織放入DNA-free管中並 儲存於攝氏-20～-80度狀態中，供未來DNA分析用。
6. 將生殖器由腹部取下以KOH溶液溶解其他非骨化區殘質，後續步驟以如同過去的生殖器解剖流程處理此結構。
7. 剩餘的腹部骨化區與附著未脫落的鱗片依序以水、70%酒精洗淨後風乾，情況許可下將此結構以水性昆蟲膠黏回標本原位。
8. 使用抽取古老DNA (acient DNA, aDNA)的kit進行DNA萃取、以小而重疊的引子設計片段來增幅目標基因，後續再以軟體編輯整段目標基因的片段以及重建其親緣關係。

三. 結果
文章作者選用四隻標本年齡在45~103年的天蛾科Hyles屬標本進行測試，將所選取粒線體的三個基因 (COI, COII, tRNA-leu)分成13個長度約110–280 bp的片段進行定序，成功率在81~88%(最古老的103年標本達84%)。相較於過去以古標本足部來抽取DNA的方法，新方法可獲得更大的DNA量。 而新方法使取用腹部與生殖器進行形態分析的事件透過步驟的改變獲得了DNA抽取的加值與標本破壞的可能性降低。然而整個流程也有一些小缺點：(1) 比傳統上以KOH溶液溶解非骨化組織、並直接取得乾淨的生殖器結構資訊來得費時(傳統上只需數小時至一天，新方法至少需兩天半) 以及(2)需要準備更多的設備，例如DNA-free的解剖器具與瓶管容器。 此外，新方法亦可使用於年輕標本，只要選擇適當的kit即可操作。

相關文獻:
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4. Kehlmaier, C. and T. Assmann. 2010. Molecular analysis meets morphology based systematics – a synthetic approach for Chalarinae (Insecta: Diptera: Pipunculidae). Systematic
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5. Kitching, I. J. 2002. The phylogenetic relationships of Morgan’s Sphinx, Xanthopan morganii (Walker), the tribe Acherontiini, and allied long-tongued hawkmoths (Lepidoptera:
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受保護之西班牙水青蛾的十個多型性微衛星體基因座之特性

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Characterization of ten polymorphic microsatellite markers for the protected Spanish moon moth Graellsia isabelae (Lepidoptera: Saturniidae)

M. Vila, N. Mari Mena, S-H. Yen & C. Lopez-Vaamonde (2009)
Conservation Genetics. DOI 10.1007/s10592-009-9905-1

本研究發展出十個西班牙月蛾的多型性微衛星體基因座。作者對來自一個西班牙族群(Els-Ports-de-Beseit, Catalonia)的20個個體、39個來自法國山區的個體和6個來自西班牙其他地點的個體進行多型性的評估。整體而言，基因座上的對偶基因數量範圍為 5-24個。 Els-Ports-de-Beseit族群每個基因座上的平均對偶基因數量是 9.80 (SD = 4.32)，異型合子比例為 0.71 (SD = 0.226)，異型合子比例的期望值是0.788 (SD = 0.146)。Catalonia族群的基因型頻率符合哈溫平衡，且沒有觀察到連鎖不平衡的證據。由這組標誌所得之多基因座基因型將可應用在判斷此高度保育蛾種的遺傳岐異度與族群間的分化。有一些基因座在兩種近緣種上被找到且具有多型性: 在Actias neidhoeferi (姬長尾水青蛾)上有兩個基因座，A. luna則有三個。

Abstract Ten polymorphic microsatellite loci were developed for Graellsia isabelae. Polymorphism was assessed for 20 individuals from a Spanish population (Els-Ports-de-Beseit, Catalonia) and 39 more individuals from bone population in the French Alps and six other Spanish localities. Overall, the number of alleles per locus ranged from 5 to 24. Els-Ports-de-Beseit showed an average number of alleles per locus of 9.80 (SD = 4.32), observed heterozygosity was 0.71 (SD = 0.226), and expected heterozygosity was 0.788 (SD = 0.146). Genotypic frequencies conformed to Hardy–Weinberg equilibrium at the Catalonian population, and no evidence for linkage disequilibrium was observed. Multilocus genotypes resulting from this set of markers will be useful to determine genetic diversity and differentiation within and among populations of this highly protected moth. Several loci amplified and resulted polymorphic in two related species: two loci in Actias neidhoeferi, and three loci in A. luna.

Graellsia isabelae 研究群: Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) - Centre d'Orléans 網站

共軛焦雷射顯微顯影於昆蟲系統分類學之應用

Use of confocal laser scanning microscopy in systematics of insects with a comparison of fluorescence from different stains

SANGMI LEE 1 , RICHARD L. BROWN 1 WILLIAM MONROE 2

1 Mississippi Entomological Museum, Mississippi State, MS, U.S.A. and 2Electron Microscope Center, Mississippi State University, Mississippi State, MS, U.S.A. Correspondence to Sangmi Lee, Mississippi Entomological Museum, Mississippi State, MS 39762-9775, U.S.A. E-mail: microlepi@hotmail.com

ABSTRACT

Confocal laser scanning microscopy has become a valuable tool for a wide range of investigations in the biological sciences, but its use in insect systematics has been neglected. Confocal microscopy depends on the degree of fluorescence of the examined specimens, which is aided either by fluorescent dyes or autofluorescence of the specimen. This study provides methods for using a combination of fluorescent dyes and autofluorescence to provide images that document the value of confocal microscopy for systematic research with insects. Fluorescence was compared from Lepidoptera genitalia dissections that were unstained or stained with merbromin (mercurochrome), safranine, chlorazol black E, eosin Y, eosin Y + chlorazol black E, and orange-G. The unstained specimen showed that chitin autofluorescences to a small degree. The comparison of stains showed that use of eosin Y provides the best images, followed by safranine and mercurochrome. Orange-G and chlorazol black are the least fluorescent and provide poor images, even when chlorazol black is combined with eosin.